D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Die fitopatogene swam Colletotrichum coccodes veroorsaak gevaarlike siektes by aartappels en tamaties, bekend as antraknose en knol swartvlek. Deur morfologiese eienskappe is dit dikwels moeilik om te onderskei van siektes wat deur ander mikroörganismes veroorsaak word; op groen tamatievrugte, kan die siekte asimptomaties wees, en manifesteer dit slegs op ryp rooi vrugte. Vir 'n vinnige en akkurate diagnose van die patogeen word 'n intydse PCR-toetsstelsel aangebied. Om 'n toetsstelsel te ontwikkel, is die nukleotiedvolgorde van die glycerol-trifosfaatdehidrogenase-geen van 45 C. bepaal, wat coccodes-stamme geïsoleer is van aartappelknolle in verskillende streke van Rusland.
Op grond van die resultate wat verkry is en die ontleding van soortgelyke reekse van ander spesies wat in die GenBank-databasis beskikbaar is, is die spesiespesifieke primers en sonde vir C. coccodes ontwerp. Om die spesifisiteit van die geskepte toetsstelsel te kontroleer, is PCR uitgevoer met DNA wat geïsoleer is van suiwer kulture van 15 verskillende soorte parasitiese en saprotrofiese swamme wat verband hou met tamatie- en aartappelplante (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Die teenwoordigheid van Colletotrichum coccodes DNA is bepaal by 'n drumpel siklus van 20-27, terwyl ander spesies na 40 siklusse opgespoor is of nie opgespoor is nie. Die toetsstelsel maak dit moontlik om C. coccodes DNA-konsentrasies van meer as 0.01 ng / mm3 in die ontleed PCR-mengsel betroubaar op te spoor. Met behulp van die ontwikkelde toetsstelsel is die voorkoms van C. coccodes in tamatieblare met simptome van swamsiektes en in aartappelknolle sonder eksterne simptome van die siekte ondersoek. Blare met simptome van swaminfeksie is versamel uit twee verskillende velde in die Krasnodar-gebied, knolle - uit lande in die Kostroma-, Moskou-, Kaluga-, Nizhny Novgorod-streek. Een tamatieblaar wat C. coccodes DNA bevat, is in die Krasnodar-gebied gevind; 'n beduidende teenwoordigheid van DNA van hierdie patogeen is opgespoor in 5 monsters van knolle wat in die Kostroma, Moskou, Kaluga streke verbou is.
Inleiding
Swamme van die geslag Colletotrichum is gevaarlike fitopatogene wat graan, groente, kruie, meerjarige vrugte en bessieplante beïnvloed. Een van die alomteenwoordige spesies van hierdie soort, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, is die veroorsakende middel van antraknose en swartvlek van aartappels en tamaties, en veroorsaak siektes van 'n aantal ander plante van die Solanaceae-familie, insluitend onkruid (Dillard, 1992). C. coccodes besmet alle ondergrondse dele van die plant, stambasisse, blare en vrugte (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Op die skil van besmette aartappelknolle word die ontwikkeling van grys kolle met onduidelike rante waargeneem waarop swart kolle van sporulasie en mikrosklerotia duidelik sigbaar is. Tydens opberging kan maagsere met versagte inhoud in die pulp van knolle vorm, d.w.s. die siekte betree die antraknose fase, wat egter baie skaars is.
Terselfdertyd is die simptome van antraknose (vetsere met klein swart kolletjies) tipies op tamatievrugte. Op blare verskyn die simptome van C. coccodes as donkerbruin kolle, gewoonlik begrens deur geel weefsel (Johnson, 1994).
Die ontwikkeling van swartvlek op die knolle bederf hul voorkoms, wat veral uitgespreek word by die verkoop van gewaste rooi skil aartappels. Skilafskilfering lei tot oormatige verdamping en verhoogde bergingsverliese (Hunger, McIntyre, 1979). Skade aan ander plantorgane lei tot verlies aan opbrengste, wat in beide oop en geslote grond opgemerk is (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Siektes veroorsaak deur C. coccodes kom algemeen voor in byna alle aartappelproduserende streke van die wêreld, insluitend Rusland (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Die bestryding van hierdie siektes is moeilik as gevolg van die onvoldoende doeltreffendheid van bestaande swamdoders teen C. coccodes en die gebrek aan weerstandbiedende variëteite (Read, Hide, 1995).
Die C. coccodes-entstof kan voortduur in saadknolle (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tamatiesaad (Ben-Daniel et al., 2010), oorleef lank in grond, op plantreste (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) en in onkruid (Raid, Pennypacker, 1987). Die werke van 'n aantal outeurs (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) het getoon dat die ontwikkeling van die siekte by aartappels en tamaties grootliks afhang van die teenwoordigheid van entstof in saad en grond. Daarom is dit nodig om die voortplantings van die swam in die saadmateriaal, in die grond, in die moere en tamatiepitte wat vir opberging gelê is, te diagnoseer (insluitend kwantitatief). Morfologiese diagnostiek in grond en plantmateriaal kan slegs uitgevoer word deur die teenwoordigheid van mikrosklerotia, wat egter ook in ander soorte swamme voorkom.
Die simptome op die knolle is baie soortgelyk aan die silwer skurfte wat deur die swam Helminthosporium solani veroorsaak word. Isolasie van Colletotrichum coccodes en Helminthosporium solani in 'n suiwer kultuur is taamlik moeilik en duur lank as gevolg van die stadige groei op 'n voedingsmedium. Om vinnig Colletotrichum-kodes te identifiseer, is dit nodig om instrumentele diagnostiese metodes te gebruik. Die maklikste metode is polimerase kettingreaksie (PCR) en die wysiging daarvan - intydse PCR. Op die oomblik word 'n toetsstelsel ontwikkel deur Britse navorsers (Cullen et al., 2002) vir die ITS1-streek van rDNA in Europa en die Verenigde State. Die gebruik daarvan het goeie resultate getoon in die analise van Russiese isolate (Belov et al, 2018). C. coccodes is egter baie wisselvallig en die opsporing daarvan uit een DNA-volgorde kan lei tot vals negatiewe resultate. Vir 'n betroubaarder diagnose is dit nodig om verskeie spesiespesifieke DNA-reekse te ontleed, waarmee ons 'n oorspronklike toetsstelsel ontwikkel het wat die identifisering van C. coccodes moontlik maak deur die volgorde van die gliseraldehied-3-fosfaatdehidrogenase-geen.
Materiale en metodes
Om die effektiwiteit en spesifisiteit van die geskepde toetsstelsels te bepaal, het ons suiwer kulture van 15 soorte swamme gebruik wat deur die outeurs geïsoleer is van siek monsters van tamatieblare en vrugte, aartappelknolle (Tabel 1). Vir isolasie is die organe van plante met simptome van swaminfeksie geneem, nie meer as een orgaan per bos nie.
'N Sny knol met 'n skil, 'n sny tamatievrug en 'n aangetaste blaar is onder 'n verkykermikroskoop geplaas, waarna mycelium, spore of 'n stuk weefsel na 'n agarmedium (wortagar) in 'n Petri-skaal met 'n skerp dissekteernaald oorgedra is. Die isolate is op agar-skuins in proefbuise by 4 ° C gestoor.
Monsters van tamatieblare met simptome van swamsiektes, bedoel vir analise, onmiddellik na versameling (in die veld) is in 70% etielalkohol geplaas waarin dit geberg is tot DNA-isolasie. Aartappelknolle is by die laboratorium afgelewer, daaruit geskil (2 x 1 cm stuk) en gevries by -20 ° С. Bewaar gevries tot DNA-isolasie.
Suiwer kulture van swamme vir DNA-isolasie is in vloeibare ertjie-medium gekweek. Die mycelium van die swam is uit die vloeibare medium verwyder, op filterpapier gedroog, in vloeibare stikstof gevries, gehomogeniseer, in CTAB-buffer geïnkubeer, met chloroform gesuiwer, neergeslaan met 'n mengsel van isopropanol en 0.5 M kaliumasetaat, twee keer gewas met 2% alkohol. Die resulterende DNA is opgelos in gedeïoniseerde water en gestoor by -70 ° C (Kutuzova et al., 20). DNA-konsentrasie is gemeet met behulp van 'n HS DNA-kwantifiseringskit vir dubbelstrengs DNA op Qubit 2017 (Qiagen, Duitsland). Die alkoholiese en bevrore monsters is in vloeibare stikstof geskeur en DNA-ekstraksie is uitgevoer soos hierbo beskryf (vir die miselium van suiwer swamkulture).
Tabel 1. Oorsprong van die gebruikte swamstamme
Sampioennaam | Plant, orrel | Plek van keuse |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | aartappelknol | Kostroma-streek, aartappelknolle van die eerste veldgenerasie, kultivar Red Scarlett |
Colletotrichum-kodes 4 | aartappelblaar | Rep. Mari El, Josjkar-Ola |
Helminthosporium solani | aartappelknol | Magadan-streek, pos. Tent, aartappelknol |
Cladosporium fulvum | tamatieblaar | Moskou-streek, tamatie met groot vrugte |
Alternaria tomatophila | tamatievrugte | ingedien deur die personeel van die laboratorium vir mikologie en fitopatologie van die All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tamatievrugte | Krasnodar-gebied, distrik Krymsky, graad Cream |
Fusarium oxysporum | koringwortel | Moskou streek |
PCR is uitgevoer op 'n DTprime-versterker (DNA-tegnologie). Vir PCR is oorspronklike primers en 'n sonde vir die spesiespesifieke streek van die gliserol-trifosfaatdehidrogenase geen gebruik: vorentoe primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, omgekeerde primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Die primers versterk 'n streek van 213 bp.
Die reaksie het 50 ng totale DNA (in die ontleding van blare en knolle) en 10 ng (in die analise van DNA van suiwer kulture van swamme) geneem. Die reaksiemengsel (35 μl) is deur 'n paraffienlaag in twee dele geskei: die onderste (20 μl) bevat 2 μl 10 × reaksiebuffer (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tussen 20), 0.5 mM van elke deoksinukleotiede trifosfaat, 7 pmol van elke onderlaag, en 4 pmol van 'n hidroliseerbare fluoresserende sonde; die boonste bevat 1 μl 10 × PCR buffer en 1 U Taq polimerase.
Deur die mengsel met paraffien te skei, kan die buise lank opgeberg word by 'n temperatuur van 5 ° C en 'n warm begin bied vir PCR nadat dit 10 minute verhit is tot 'n temperatuur bo 80 ° C. PCR is volgens die volgende program uitgevoer: 94.0 ° C - 90 s (1 siklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 siklusse); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 siklusse); 10.0 ° C - stoor.
Resultate en bespreking
Die rye van die glycerol-trifosfaatdehidrogenase-geen is bepaal in 45 stamme wat geïsoleer is van blare, stingels, aartappelknolle en tamatievrugte (Kutuzova, 2018) in verskillende streke van Rusland. Die bestudeerde rye van alle stamme is verdeel in 2 groepe wat in twee nukleotiede verskil. Die nukleotiedreekse van verteenwoordigers van beide groepe onder die nommers KY496634 en KY496635 word in GenBank gedeponeer.
Die primers coc70gdf, coc280gdr en die cocgdz-sonde wat op hul basis ontwerp is, is met behulp van die BLAST-program nagegaan (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) op alle rye van die gliserol-trifosfaatdehidrogenase geen van spesies van die genus Colletotrichum en ander organismes beskikbaar in die GenBank databasis.
Geen DNA-streke van ander organismes wat baie homoloë met primers en sonde is nie, is gevind nie.
Die sensitiwiteit van die toetsstelsel is nagegaan met behulp van monsters met verskillende konsentrasies C. coccodes DNA, DNA van 'n aartappelblaar wat met antraknose besmet is (versamel in 2017 in Mari El, variëteit Red Scarlett) en skil van knolle wat deur swartvlek aangetas is (versamel in die Kostroma-streek, verskeidenheid Rooi Scarlett, Tabel 2). Om die teenwoordigheid van DNA in knolle en aartappelblare te bevestig, is C. coccodes-stamme daarvan in suiwer kulture geïsoleer.
Die resultate van die sensitiwiteitsanalise van die toetsstelsel toon dat dit gebruik kan word om die teenwoordigheid van C. coccodes DNA in 'n monster suksesvol te diagnoseer wanneer die totale inhoud in die PCR-mengsel meer as 0.05 ng is. Dit is voldoende om op te spoor, aangesien een sclerotia gemiddeld 0.131 ng bevat en een spore ongeveer 0.04 ng DNA bevat (Cullen et al., 2002). Die toetsstelsel wat deur die Engelse groep ontwikkel is (Cullen et al., 2002) het 'n soortgelyke sensitiwiteit getoon (drempelsiklus 34 op 0.05 ng DNA en 37 op 0.005 ng).
Analise van natuurlike monsters wat C. coccodes bevat, het dit in alle gevalle moontlik gemaak om die teenwoordigheid daarvan in die monster betroubaar te openbaar (Tabel 2). Die voorgestelde metode vir DNA-isolasie was ook van toepassing op die ontleding van natuurlike plantmonsters.
Tabel 2. Bepaling van die sensitiwiteit van die voorgestelde toetsstelsel vir die identifisering van Colletotrichum-kodes vir intydse PCR
Образец | DNA-hoeveelheid in monster *, ng | Drempel siklus | C. opsporing van kodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum-kodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Knolskil 1 | 50 | 32 | + |
Knolskil 2 | 50 | 30 | + |
Knolskil 3 | 50 | 31.5 | + |
Aartappelblaar | 50 | 29.5 | + |
Let wel. * In 'n mengsel van PCR-produkte.
Die spesifisiteit van die toetsstelsel is getoets op DNA-monsters wat uit 15 soorte swamme onttrek is. Al die soorte swamme is deur die outeurs geïsoleer van gesonde vrugte en blare van tamatie, aartappelknolle; een stam is van koringwortel geïsoleer (tabel 1). Onder die spesies wat van die vrugoppervlak geïsoleer is, is daar ook spesies wat nie patogeen vir tamatie is nie (byvoorbeeld Phellinus ferrugineovelutinus).
Studies het getoon dat C. coccodes DNA opgespoor is by 'n drempelsiklus van 20-27, terwyl ander swamsoorte nie opgespoor is nie of 'n sein na siklus 40 gegee het, wat toegeskryf kan word aan 'n nie-spesifieke geraaseffek (Tabel 3).
Tabel 3. Kontroleer die toetsstelsel vir verskillende soorte sampioene
Sampioennaam | Drempel siklus |
Colletotrichum-kodes 1 | 20.9 |
C. kodes 2 | 22.6 |
C. kodes 3 | 23 |
C. kodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium SP. | > 40 |
Let wel. * Die hoeveelheid DNA in alle monsters was 10 ng.
Die ontwikkelde toetsstelsel is gebruik om C. coccodes te identifiseer in tamatieblaarmonsters met simptome van nekrotrofiese patogene en moere sonder moere sonder sigbare simptome. Vir die studie het ons saadknolle geneem van verskillende variëteite wat in die Kostroma-, Moskou-, Kaluga-, Nizhny Novgorod-streek gekweek is. Die teenwoordigheid van C. coccodes DNA word as betekenisvol beskou in die monsters, in die analise waarvan die drempel siklus nie 35 oorskry het nie. Hierdie drempelwaarde is gekies op grond van die betroubare bepaling van 0.05 ng C. coccodes DNA (drempel siklus 33.5, Tabel 2) en die feit dat drempelsiklusse bo 40 is nie-spesifieke DNA van sommige ander soorte swamme gediagnoseer. Met hierdie benadering is die beduidende teenwoordigheid van C. coccodes-DNA opgespoor in 5 monsters van knolle wat in die Kostroma-, Moskou-, Kaluga-streek en in een tamatieblaar uit die Yeisk-distrik in die Krasnodar-streek gekweek is (Tabelle 4, 5).
Tabel 4. Opsporing van Colletotrichum-kodes op aartappelknolle *
Voorbeeldnommer | Aartappelvariëteit | Groeiplek | C. opsporing van kodes | Drempel siklus |
---|---|---|---|---|
1 | Rooi skarlaken | Kostroma-streek | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskou streek | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky vroeg | Moskou streek | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga-streek | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasie | Kaluga-streek | - | |
15 | gala | Nizhny Novgorod streek. | - | |
16 | - |
Let wel. * Die hoeveelheid DNA in alle monsters was 50 ng.
Tabel 5. Opsporing van Colletotrichum-kodes op tamatieblare *
Voorbeeldnommer | Groeiplek | C. opsporing van kodes | Drempel siklus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-gebied, Krim-distrik | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-gebied, distrik Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Die hoeveelheid DNA in alle monsters was 50 ng.
Die toetsstelsel wat deur ons geskep is, is nie minderwaardig as wat die Britse navorsers (Cullen et al., 2002) met betrekking tot sensitiwiteit en spesifisiteit ontwikkel het nie, en is geskik vir die ontleding van plantmonsters. Die toepassing daarvan vir die ontleding van saadknolle het dit moontlik gemaak om C. coccodes DNA in knolle te identifiseer sonder uiterlike tekens van skade en om die infeksie van blare suksesvol te ontleed.
Tot op hede is nog geen ontleding gedoen van aartappelknolle vir C. coccodes-besmetting nie. Ons eerste studie het getoon dat uit 16 getoetsde saadknolle wat in verskillende streke van die Russiese Federasie gekweek is, 5 C. coccodes bevat. Dit wys dat swartvlek van aartappelknolle 'n algemene aartappelsiekte in Rusland is, en dat sy rol in die vermindering van die volume en kwaliteit van die aartappelgewas onderskat word.
Analise van tamatieblare het 'n beduidende teenwoordigheid van C. coccodes DNA in een blaar uit die Yeisk-distrik in die Krasnodar-gebied getoon. Vroeër, wanneer tamatievelde in die suide van Rusland met behulp van die Britse toetsstelsel (Cullen et al., 2002) ondersoek is, is blare bevat wat C. coccodes bevat, en in sommige velde is 'n groot hoeveelheid blare wat met C. coccodes besmet is, gevind (Belov et al., 2018). In die Krasnodar- en Primorsky-gebied, die streek Moskou, het ons tamatievrugte gevind, waaruit ons daarin geslaag het om suiwer kulture van C. coccodes te isoleer. Dit is moontlik dat C. coccodes in Rusland meer verspreid is oor tamaties as wat nou geglo word, en die skadelikheid daarvan word ook onderskat.
Dus is daar tot op hede genoeg inligting versamel oor die wydverspreide verspreiding van C. coccodes op aartappels en tamaties.
Om die rol van hierdie swam beter te verstaan in die ontwikkeling van aartappel- en tamatiesiektes, is dit nodig om die voorkoms daarvan in Rusland te monitor, die rol van grond- en saadinfeksies en die rol van swartvlek in verliese tydens opberging te bestudeer. Die gebruik van PCR-diagnostiek kan hierdie werk aansienlik vergemaklik, en die gelyktydige gebruik van beide toetsstelsels sal die akkuraatheid van die analise aansienlik verhoog.
Hierdie werk is ondersteun deur 'n toekenning van die Russian Science Foundation No. 18-76-00009.
Die artikel is gepubliseer in die tydskrif "Mycology and Phytopathology" (volume 54, nr. 1, 2020).