EET. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Onlangs is aangetoon dat die ascomycete-swam Ilyonectria crassa aartappelknolle kan besmet. Hierdie werk is die eerste wat die biologiese eienskappe en weerstand teen sommige swamdoders van die I. crassa-stam wat van aartappels geïsoleer is, ontleed. Die reekse van spesiespesifieke streke van die "aartappel" -stam val saam met dié wat vroeër verkry is vir swamme wat geïsoleer is van die wortels van narcis, ginseng, asp en beuk, leliebolle en tulpblare. Blykbaar kan baie wilde en tuinplante reservate van I. crassa wees. Die ondersoekte stam het tamatie- en aartappelskywe besmet, maar het nie die hele tamatievrugte en ongeskonde aartappelknol besmet nie. Dit wys dat I. crassa 'n wondparasiet is. Evaluering van weerstand teen fludioxonil, difenoconazole en azoxystrobin op 'n voedingsmedium het 'n hoë effektiwiteit van hierdie middels getoon.
Die EC50-aanwyser (die konsentrasie van die swamdoder, wat 2 keer die radiale groeisnelheid van die kolonie in vergelyking met die swamdodervrye beheer vertraag) was gelyk aan 0.4; 7.4 en 4 mg / l onderskeidelik. Die moontlikheid van die ontwikkeling van die siekte wat deur I. crassa veroorsaak word, moet in ag geneem word by fitopatologiese evaluering van aartappelknolle en die ontwikkeling van gewasbeskermingsmaatreëls.
Die ontwikkeling van fitopatogene mikro-organismes lei tot groot verliese in alle stadiums van die kweek en berging van aartappels. By die beplanning van beskermingsmaatreëls word gewoonlik bekende patogene in ag geneem, soos die spesies van die genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, ens. In onlangse jare verskyn daar egter al hoe meer verslae oor die voorkoms van nuwe fitopatogene mikro-organismes op aartappels. Hul biologie is swak bestudeer, die doeltreffendheid van swamdoders wat op aartappels gebruik word, is onbekend. Diagnostiese metodes is nie ontwikkel nie. Met massiewe ontwikkeling kan hulle die aartappeloes aansienlik beskadig. Een van hierdie mikroörganismes is die ascomycete-swam Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, wat die eerste keer deur die outeurs op aartappelknolle ontdek is (Chudinova et al., 2019).
Hierdie werk bied die resultate van die analise van die I. crassa-stam wat van aartappelknolle geïsoleer is. Die morfologie van kolonies en myceliale strukture van I. crassa, nukleotiedreekse van spesiespesifieke DNA-streke, virulensie teen aartappels en tamaties, en weerstand teen sommige gewilde swamdoders is bestudeer.
Materiale en metodes
Ons het die I. crassa 18KSuPT2-stam gebruik wat in 2018 geïsoleer is van die aangetaste aartappelknol wat in die Kostroma-streek verbou is. Die knol is aangetas deur 'n droë verrottingstipe met 'n holte bedek met ligbruin mycelium. Met behulp van 'n steriele dissekteernaald is die swammyselium in 'n Petri-skaal oorgedra met 'n agarmedium (bierwort 10%, agar 1.5%, penicillien 1000 U / ml). Die plate is in die donker by 24 ° C geïnkubeer.
'N Leica DM2500 ligmikroskoop met 'n ICC50 HD digitale kamera en 'n Leica M80 binokulêre mikroskoop met 'n IC80HD digitale kamera (Leica Microsystems, Duitsland) is gebruik om die grootte en morfologie van spore en sporeorgane te fotografeer, te evalueer.
Om DNA te isoleer, is die swammyselium in vloeibare ertjie-medium gekweek, daarna in vloeibare stikstof gevries, gehomogeniseer, in CTAB-buffer geïnkubeer, met chloroform gesuiwer en twee keer met 2% alkohol gewas.
Die DNA-ekstraksie-metode word breedvoerig beskryf in die artikel deur Kutuzova et al. (2017).
Om die spesie volgens molekulêre metodes te bepaal en te vergelyk met ander bekende I. crassa-stamme, is PCR uitgevoer met primers wat amplifikasie van spesiespesifieke DNA-streke moontlik gemaak het: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), geenstreke b -tubulien (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) en vertaalverlengingsfaktor 1α (tef1α) (primers EF1-728F / EF1-986R, Carbone en Kohn, 1999). Amplikons van die gewenste lengte is met behulp van die Evrogen CleanUp-kit uit die gel gehaal. Die versterkte streke is opeenvolg met die BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, VSA) op 'n Applied Biosystems 3730 xl outomatiese sequencer (Applied Biosystems, CA, VSA). Die verkreë nukleotiedreekse is gebruik om 'n pasmaat te soek in die GenBank-databasis van die Amerikaanse Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting (NCBI). Filogenetiese analise is uitgevoer met behulp van die MEGA 6-program (Tamura et al., 2013).
Bepaling van virulensie is uitgevoer op heelgroen vrugte van grootvrugte tamatie (Dubrava-variëteit) en aartappelknolle (Gala-variëteit). Daarbenewens het ons snye van dieselfde vrugte en knolle gebruik om skade aan beskadigde vrugte en knolle te simuleer. Snye knolle is in vogtige kamers geplaas, wat petri-skottelgoed was met nat filterpapier aan die onderkant. 'N Skyfie is op die papier geplaas waarop skyfies knolle of vrugte geplaas is. Heel knolle en vrugte is ook in houers geplaas met nat filterpapier aan die onderkant. In die middel van die sny (of op die ongeskonde oppervlak van die knol of vrugte) is 'n stuk agar (5 × 5 mm) met swam-hifes geplaas na 5 dae se groei op wortagar.
Die assessering van die weerstand van swamstamme teen swamdoders is in laboratoriumtoestande op agarvoedingsmedium uitgevoer. Ons het die vatbaarheid vir swamdodende middels bestudeer Maxim, KS (aktiewe bestanddeel fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Staatskatalogus ..., 2020). Evaluering is uitgevoer in Petri-skottels op 'n wort-agar-medium met die toevoeging van die bestudeerde geneesmiddels in 'n konsentrasie van die aktiewe stof van 0.1; een; 1 dpm (mg / l) (vir fludioxonil en difenoconazole), 10; tien; 1 dpm (vir azoksistrobien) en in media sonder swamdoder (beheer). Die swamdoder is by die gesmelte gevoeg en afgekoel tot 10 ° C medium, waarna die medium in Petri-skottels gegooi is. 'N Agarblok met swammyselium is in die middel van 'n petribakkie geplaas en in die donker by 'n temperatuur van 100 ° C gekweek. Na 60 dae se inkubasie is die diameters van die kolonies in twee onderling loodregte rigtings gemeet; die meetresultate vir elke kolonie is gemiddeld. Die eksperimente is in drievoud uitgevoer. Op grond van die resultate van die ontledings is die EC24 bereken, gelyk aan die konsentrasie van die swamdoder, wat die radiale groeisnelheid van die kolonie met die helfte van die swamdodende beheer gehalveer het.
Resultate en bespreking
Op petri-geregte met wortagar het die swam kolonies gevorm met wit flocculente mycelium. Die medium onder die miselium het rooi-bruin geword. Wanneer die medium opdroog, het die swam spore gevorm van twee soorte op enkel en saamgevoegde konidiofores in klein sporodochie. Macroconidia is langwerpig, silindries, met een tot drie septa, gemiddelde lengte 27.2 urn met 'n reeks waardes van 23.2 tot 32.2 µm, breedte - tot 4.9 urn (Fig. 1). Die gemiddelde lengte van mikroconidia is 14.3 urn met 'n reeks waardes van 10.3 tot 18.1 urn, en die breedte is tot 4.0 urn. Alle makro- en mikromorfologiese karakters pas in die variasiewydte van die spesie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Die reekse van spesiespesifieke DNA-streke (ITS, b-tubulin, TEF 1α) het heeltemal saamgeval met die reekse van die I. crassa-stamme wat ons vroeër bestudeer het (Chudinova et al., 2019, Tabel 1). Ten einde die voorkoms van I. crassa in ander streke te bestudeer en die spektrum van geaffekteerde kulture te analiseer, is soortgelyke DNA-reekse in die GenBank-databasis geanaliseer (Tabel 1). Die oorvleueling was 86 tot 100%. Die rye van al drie DNA-streke van die "aartappel" I. crassa-stam was identies aan die rye van die stamme wat geïsoleer is van die leliebol en nartjieswortels in Nederland en van die ginsengwortel in Kanada. Ons kon geen ander I. crassa-stamme met drie geanaliseerde analoogreekse in oop databasisse vind nie. Analise van die gedeponeerde ITS- en b-tubulienreekse het egter die teenwoordigheid van I. crassa op tulpblare in die Verenigde Koninkryk getoon. Swamme met 'n soortgelyke ITS-volgorde is geïdentifiseer by die ontleding van die mycobiota van wortels van as in Kanada en beukenwortels in Italië en aartappelknolle in Saoedi-Arabië (Tabel 1). Die resultate van hierdie studie toon dat I. crassa wêreldwyd versprei en verskillende plantspesies kan besmet.
By die bepaling van die patogenisiteit op snye tamatie en aartappel op die 5de dag, het die deursnee van die letsel 1.5 cm bereik. In hierdie geval het die bestudeerde stam nie die hele tamatievrugte en die ongeskonde aartappelknol besmet nie. Die kelkblare is egter op die tamatie aangetas. Om die moontlikheid van besoedeling uit te sluit, is 'n swamisolaat van die miselium wat op 'n aartappelknolskyf ontwikkel is, in 'n suiwer kultuur geïsoleer. Dit was heeltemal identies aan die ouerlike spanning. I. crassa is blykbaar 'n wondparasiet.
Voorbehandeling van saadknolle met swamdoders verminder die ontwikkeling van siektes by plante gedurende die groeiseisoen. Vir die seleksie van effektiewe swamdoders is dit belangrik om vas te stel watter van hulle effektief is teen I. сrassa. Die werk het wydverspreide aktiewe bestanddele van swamdoders bestudeer - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil is opgeneem in verskillende mengsels wat gebruik word om saad en moere te saai voordat dit geplant word. Fludioxonil (Maxim) word ook gebruik om saadknolle te behandel voor opberging. Difenokonasool en azoksistrobien word ook ingesluit in 'n aantal preparate wat gebruik word vir die verwerking van saadmateriaal, asook in preparate wat bedoel is vir die verwerking van vegetatiewe plante (Staatskatalogus ..., 2020).
Die groeitempo van I. crassa is bestudeer op media (Fig. 2) met verskillende konsentrasies aktiewe bestanddele: fludioxonil (EC50 = 0.4 dpm), azoksistrobien (EC50 = 4 dpm) en difenokonasool (EC50 = 7.4 dpm) (Tabel 2). Hierdie middels kan as baie effektief teen I. crassa beskou word, aangesien die EC50 aansienlik laer is as die aanbevole konsentrasie van die middel in die werkvloeistof wat gebruik word vir die behandeling van knolle. Volgens die Staatskatalogus ... (2020) is die konsentrasie fludioxonil in die vloeistof vir die behandeling van aartappelknolle 500 tot 1000 dpm, azoxystrobin (in die vloeistof vir die behandeling van die bodem van die voor) - 3750-9375 dpm, difenokonasool (in die vloeistof vir die behandeling van vegetatiewe plante) - 187.5– 625 dpm.
Tabel 1. Reeks ooreenkoms van spesiespesifieke reekse van stam 18KSuPT2 en stamme van Ilyonectria crassa beskikbaar in die Genbank databasis
Druk | Gasheerplant, uitskeidingsterrein | Volgennommers gedeponeer by GenBank, persentasie ooreenkomste | Link | ||
SY | β-tubulien | TEF 1α | |||
17KSPT1 en 18KSuPT2 | Aartappelknol, Kostroma-streek | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, hierdie werk |
CBS 158/31 | Narcissus roots, Nederland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Leliebol, Nederland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng-wortel, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpeblad, Verenigde Koninkryk | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspenwortels, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Beuk, Italië | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direkte inhandiging |
KAUF19 | Aartappelknol, Saoedi-Arabië | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nie gedeponeer nie
Tabel 2. Weerstand van Ilyonectria crassa teen swamdoders
(aktiewe stof) | EC50, dpm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Beheer | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonasool) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
In ons werk is I. crassa-stamme geïsoleer van aartappelknolle in die Kostroma- en Moskou-streek (Chudinova et al., 2019). 'N Groot persentasie swamstamme met ITS-reekse identies aan I. crassa is aan die lig gebring toe die mycobiota van aartappelknolle in Saoedi-Arabië ontleed is (Gashgari en Gherbawy, 2013). I. crassa is blykbaar nie so skaars op aartappels as wat dit mag lyk nie. Ons eksperimente het getoon dat die swam beskadigde tamatievrugte kon besmet. Uit die literatuur is dit bekend dat I. crassa in staat is om saprotrofies in die grond te ontwikkel (Moll et al., 2016), asook om 'n verskeidenheid plante, selfs taksonomies ver, soos affodille, lelies, ginseng, asp en beuk (Tabel 1). een). Blykbaar kan baie wilde en tuinplante reservate van I. crassa wees. Bogenoemde toon dat dit nodig is om die moontlikheid om aartappelknolle met hierdie swam te beïnvloed by die ontwikkeling van beskermingsmaatreëls in ag te neem. Wydverspreide preparate vir die behandeling van aartappelknolle wat fludioxonil, azoxystrobin en difenoconazole bevat, toon hoë swamdodende effektiwiteit teen I. crassa.
Hierdie werk is ondersteun deur die Russiese Stigting vir Basiese Navorsing (Grant No. 20-016-00139).
Die artikel is gepubliseer in die tydskrif "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)